PCR veya polimeraz zincir reaksiyonu, tıpta ve diğer bilimsel alanlarda yaygın olarak kullanılan karmaşık bir laboratuvar tekniğidir. PCR teşhisi, bir zamanlar bilimde gerçek bir atılım oldu.
Açıklama
Kantitatif PCR, bir tür gerçek zamanlı PCR'dir.
Bu, reaksiyon kinetiğinin sürekli olarak kaydedildiği ve karmaşık bir moleküler karışımdaki spesifik DNA nükleotit dizilerinin içeriğini niteliksel olarak değerlendirmeyi mümkün kılan bir PCR varyantı olarak anlaşılır.
Kantitatif PCR yöntemi aşağıda daha ayrıntılı olarak tartışılacaktır.
Analizin özü
Kültürel ve serolojik yöntemler özellikle enfeksiyonları teşhis etmek için sıklıkla kullanılır. İlki altında, kan serumunda bulaşıcı bir patojene karşı antikorlar belirlenir. İkincisinde, hasta bir kişiden alınan biyolojik materyal, patojen kolonilerinin büyümesi için uygun olan belirli bir ortamı ekmek için kullanılır. Her ikisinde de teşhisdava günler veya haftalar sürebilir.
PCR incelemesi, hasta bir kişiden elde edilen farklı biyolojik materyallerle yapılabilir. Kan ve diğer patolojik, fizyolojik ve biyolojik ortamlar ve sıvılar numune görevi görür. PCR dışkı veya idrar yapabilirsiniz.
Atipik ve viral enfeksiyonlar genellikle kantitatif PCR ile teşhis edilir, çünkü bunların tetiklediği patolojik sürecin özel doğası nedeniyle teşhis edilmesi kolay olmayabilir. Bu tür enfeksiyonları belirlemek için, serolojik yöntemlerle belirlenen antikorların vücutta üretilmeye başladığı zaman alır. Ancak bu bazı durumlarda kabul edilemez.
Uygulama yöntemi
PCR yöntemi - hastadan izole edilen örneklerde enfeksiyonun laboratuvarda tespiti (in vitro).
Polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirmek için bir dizi özel reaktif gereklidir.
Test malzemesi, reaktiflerle birlikte test tüplerine verilir. Test tüpleri özel bir aparata yerleştirilir - istenen RNA veya DNA fragmanlarını çoğ altmak (sayısını artırmak) için tasarlanmış bir PCR amplifikatörü, PCR amplifikatörü döngüsel bir modda çalışır. Herhangi bir döngüde, numuneler patojenin RNA veya DNA dizisini içeriyorsa, bu nükleik asitlerin parçacıklarının giderek daha fazla kopyası çözeltide birikir. Patojenin varlığını ve örneklerdeki miktarını belirleyebilirsiniz.
PCR Türleri
PCR ile kalitatif analiz, aşağıdaki sonucu elde etmenizi sağlar:
- negatif, ilgilenilen patojen numunelerde bulunmadığında;
- Belirli bir patojenin karakteristiği olan örneklerde diziler bulunursa pozitiftir.
Pozitif bir PCR sonucuyla, teşhis edilmiş bir enfeksiyonun varlığı hakkında %95 doğrulukla konuşabiliriz. Aynı zamanda tanı amaçlı kullanılan PCR setlerinin doğruluğu %100'e ulaşır.
Genellikle hatalı sonuçların %5'i insan faktörü tarafından belirlenir. Örneğin, reaktiflerin analiz ve saklama tekniğinin ihlali, çalışmanın doğruluğunu önemli ölçüde az altabilir.
Kantitatif PCR, viral yük kavramını tanımlar. Hastadan alınan örneklerde kaç adet patojen DNA seti olduğunu belirlemek mümkündür.
Enfeksiyonun şiddeti, sayılarının artmasıyla doğru orantılıdır. Viral yükü az altmak için tedavinin başarısını da belirleyebilirsiniz.
PCR biyomateryali için gönderme
Kantitatif PCR, klinikte özellikle sabahları gerçekleştirilir. Doktor ziyareti sırasında hastaya ne alması gerektiği söylenecektir: kazıma, bulaşma, idrar veya kan. PCR, materyalin kontaminasyon seviyesinden bağımsız olarak patojenleri tespit edebilir.
Pozitif bir analiz için teorik olarak örneklerde yalnızca bir patojenin bulunması gerekir. Uygulamada, daha da uygun koşullar yaratmaya çalışıyorlar. Bunun için bazı öneriler var:
- cinsel organlarından kazıma veya sürüntü alırlarsaorganlar, çalışmadan üç gün önce yakın ilişkiden kaçınmanız gerekir;
- Antibakteriyel ilaçlarla duş yapamazsınız veya analizden önce kendinizi yıkayamazsınız;
- üretradan yayma almadan üç saat önce sabırlı olmanız ve bağırsaklarınızı boş altmamanız gerekir.
Kan bağışlarken bu kurallara uymayın.
Niteliksel PCR analizinin sonuçları nasıl yorumlanır?
Elde edilen sonuçların nicel değerlendirmesi
Bazı klinik durumlarda, tedavinin etkinliği ve / veya patoloji sürecinin dinamikleri sorunu ortaya çıkar. Bu tür sorular özellikle kronik enfeksiyonlu (insan immün yetmezlik virüsü, hepatit B ve C) kişileri incelerken önemlidir. Teşhis yapılırken, amplikonların (PCR ürünleri) birikiminin, analiz edilen örnekte istenen genin kopyalarının varlığı ile orantılı olduğu gerçeğine dayanırlar.
Tabii ki nicel PCR sonuçları dikkate alınarak özel PCR sinyallerinin yoğunluğunun incelenmesi ile jel elektroforezi ile yapılır. Ayrıca, elde edilen sonuçların doğru bir nicel değerlendirmesi için bir ön koşul, istenen genin bilinen sayıda kopyasını içeren pozitif güvenilir kontrol örnekleridir (örneğin, bir PCR reaksiyonu için hepatit C geninin bin kopyası). Kantitatif kontrolün birkaç seri dilüsyonu, kalibrasyon eğrilerinin oluşturulmasına izin verir ve klinik örneklerdeki klinik genokopilerin içeriğini değerlendirmek için kullanılır.
Kantitatif PCR tanımında, önemli bir başarı,basit primerlerle aynı anda reaksiyon karışımına eklenen floresan DNA probları ve PCR sürecini zamanında, yani gerçek zamanlı PCR'de izlemenizi sağlar.
TaqMan metodolojisi, amplikonun orta kısmına özgü ve uçlarında iki etiket bulunan floresan DNA problarının sentezini ifade eder. Bunlardan biri floresan etiket, ikincisi ise bu floresan için söndürücü molekül.
Florimetre ve termoblok-amplifikatörün melezi olan özel bir cihaz, her test tüpünde sabit flüoresans ölçümleri yapar (gerçek zamanlı PCR prensibi). 20-40 PCR döngüsünden sonra, her numune için ayrı eğriler elde edilecektir. Test örneğinde bulunan istenen genin kopya sayısı, kontrol örnekleri ile kalibrasyon eğrilerinden hesaplanabilir.
Ayrıca, PCR'nin floresan yöntemiyle uygulanmasının önemli bir özelliği, sonuçlar dikkate alındığında PCR karışımı ile tüpleri açmaya gerek olmamasıdır. Bu, amplifikasyon ürünleriyle oda kontaminasyonu olasılığını az altır ve elektroforez için özel çalışma alanları ayırmaya gerek yoktur.
Kantitatif bir PCR transkripti ne gösterir?
Ne keşfediliyor?
Kantitatif PCR gibi bir yöntemle, genlerdeki kalitatif değişiklikler bulunur: eklemeler, silmeler ve nokta mutasyonları. Ancak bazı kalıtsal bozukluklarda, belirli genlerin içeriğindeki bir değişikliğe yanıt olarak karşılık gelen semptomlar ortaya çıkar.
TeşekkürlerKantitatif analiz, çoğunlukla IU / ml cinsinden sayısal bir sonuç verir. Bu, test örneğinin bir mililitresinde, uluslararası birimlerle ölçülen patojenin RNA veya DNA'sının belirli sayıda kopyasının bulunduğu anlamına gelir.
Büyüklüğüne bağlı olarak, enfeksiyonun şiddeti teşhis edilir. Virüsler hastalık sırasında kanda serbestçe hareket ettiğinden, kan genellikle viral yükü belirlemek için test edilir.
Özellikler
Kan testinde kantitatif PCR'nin iki özelliği vardır.
- Analiz, oluşturulan PCR ürününün içeriğini doğru bir şekilde belirlemek için bir floresan veya radyoaktif etiketle etiketlenen primerler veya deoksiribonükleosit trifosfatların varlığında gerçekleştirilir.
- PCR işleminde, çok fazla PCR ürünü görünmeden önce reaksiyonu erken sonlandırın. Bunun nedeni, doygunluğun son aşamasında, çok sayıda PCR ürünü olduğunda, hem enzimin hem de substratların bu reaksiyonun sınırlayıcı halkaları olarak hareket etmesidir. Bu koşullar altında bir sonraki PCR döngüsünün sonu, artık PCR ürünlerinin sayısının iki katına çıkmasıyla karakterize edilmez, bir dizi reaksiyon döngüsünden geçtikten sonra erken aşamalarda oldukça açık bir şekilde tanımlanan farklı numuneler arasındaki önemsiz niceliksel farklılıklar seviyelenir..
PCR teşhisinin maliyeti
PCR araştırmasının, ne tür bir enfeksiyonun test edileceğine, analiz metodolojisine ve test materyaline bağlı olarak bir maliyeti vardır. Bir enfeksiyon belirlemek için, içinde vermek zorunda kalacaksınız200-800 ruble. Biyomateryal almak için bir ücret de eklenir - yaklaşık 400 ruble.
