Akış sitometrisi, hücrelerin derinlemesine analizi için kullanılan sitolojik bir araştırma yöntemidir. Avantajı, her hücreyi ayrı ayrı incelemenize izin vermesidir. Bu analiz türü, yüzlerce hücrede birkaç parametreyi saniyeler içinde değerlendirmeye yardımcı olur. Sonuç olarak, sitoflorimetri, bilim adamları ve klinisyenler için şu anda mevcut olan en hızlı ve en doğru analiz yöntemlerinden biri olarak kabul edilir.
İlke
Akış sitometrisinin ilkesi, hücrelerin ışık saçılımı ve lüminesansının (floresan) ölçülmesine dayanır. Hücre süspansiyonu, bir lazerle ışınlandığı sitometre hücresinden yüksek hızda bir akım olarak geçirilir. Sözde hidrodinamik odaklama da burada gerçekleştirilir. Mekanizması, çıkışta incelenen parçacıkların bulunduğu hücreden gelen akışın, daha yüksek bir hıza sahip olan harici jete akmasıdır. Sonuç olarak, parçacıklar sıralı bir zincirde hizalanır.
Ön hücreler özel floresan boyalarla (florokromlar) etiketlenmiştir. Onlar sayesinde lazer ışınıikincil bir parıltıyı heyecanlandırır. Alınan ışık sinyalleri dedektörler tarafından kaydedilir. Daha sonra bilgiler, bazı kriterlerde farklılık gösteren tek tek hücre popülasyonlarını saymanıza izin veren yazılım algoritmaları kullanılarak işlenir.
Geleneksel mikroskopi ile yapılan araştırmalar, aynı göründükleri için genellikle farklı hücreler arasında ayrım yapmakta başarısız olur. Sitoflorimetri, diğer verileri (DNA yapı bütünlüğü) sağlayabilir, protein ekspresyonunu, hücre sağkalımını analiz edebilir.
Florokromların uyarılması, farklı dalga boylarında ışık huzmelerinin yanı sıra farklı dedektör türlerini gerektirdiğinden, modern kurulumlar birkaç algılama kanalı (4'ten 30'a kadar) ile donatılmıştır. Lazer yayıcıların sayısı 1 ila 7 arasında olabilir. Daha karmaşık cihazlar, aynı anda parçacıkların çeşitli özelliklerinin çok parametreli çalışmalarına izin verir.
Avantajlar ve dezavantajlar
Akış sitometrisinin faydaları şunlardır:
- yüksek işlem hızı (1 saniyede 30 bine kadar olay kaydı);
- çok sayıda hücreyi inceleme imkanı (bir örnekte 100 milyona kadar);
- Floresan ışığının yoğunluğunu ölçmek;
- her hücrenin analizi;
- heterojen süreçlerin eşzamanlı çalışması;
- hücre popülasyonlarına göre verilerin otomatik olarak ayrılması;
- sonuçların kaliteli görselleştirilmesi.
Bu teknolojinin bir başka özelliği de şudur:analiz edilen partikül birkaç floresan solüsyonla boyanabilir. Bu sayede çok parametreli bir çalışma gerçekleşir.
Dezavantajları arasında teknik ekipmanın karmaşıklığı ve özel numune hazırlama ihtiyacı yer alır.
Sitometreler
Bu türdeki ilk cihazlar Almanya'da zaten 1968'de ortaya çıktı, ancak çok daha sonra yaygınlaştı. Şu anda, akış sitometrisi yöntemiyle çalışan tüm cihazlar 2 türe ayrılabilir:
- floresan radyasyonu (iki veya daha fazla dalga boyu), 10° ve 90° ışık saçılımını ölçen cihazlar (düşük açılı ve yan saçılım dedektörü);
- birkaç hücresel parametreyi ölçmenin yanı sıra, bu kriterlere göre otomatik olarak gruplara ayrılan cihazlar.
İleri dağılım detektörü hücrenin boyutunu belirlemek için tasarlanmıştır ve yan dağılım cihazı hücre içi granüllerin varlığı, sitoplazmanın ve çekirdeğin hacim oranı hakkında bilgi almanızı sağlar.
Klasik sitometreler, ışık mikroskoplarının aksine, hücre görüntüsünün elde edilmesine izin vermez. Bununla birlikte, son yıllarda, bir mikroskop ve bir sitoflorimetrenin özelliklerini birleştirebilen birleşik cihazlar geliştirilmiştir. Aşağıda tartışılacaktır.
Görüntüleme Sitometreleri
Klasik akış sitometrisinde kullanılan aletler için,bir özellik karakteristiktir: analiz edilen hücrelerin popülasyonunda nadir olaylar kayıtlıysa, özlerinin ne olduğunu değerlendirmenin bir yolu yoktur. Bu parçacıklar ya ölü hücrelerin kalıntıları ya da bunların nadir bir grubu olabilir. Geleneksel cihazlarda, bu tür veriler, olayların genel akışından hariç tutulur, ancak bilimsel ve klinik analiz için özel değere sahip olabilen onlardır.
Yeni nesil görüntüleme akış sitometreleri, akışta dedektör bölgesinden geçen her hücrenin bir görüntüsünü yakalamanıza olanak tanır. Bilgisayar monitöründe görüntülenen diyagramın ilgili alanına tıklayarak bunu görmek kolaydır.
Uygulama alanları
Akış sitometrisi, tıp ve bilimin birçok alanında kullanılan evrensel bir yöntemdir:
- immünoloji;
- onkoloji;
- transplantology (kırmızı kemik iliği, kök hücre nakli);
- hematoloji;
- toksikoloji;
- biyokimya (hücre içindeki asitlik ölçümü, diğer parametrelerin incelenmesi);
- farmakoloji (yeni ilaçlar yaratmak);
- mikrobiyoloji;
- parazitoloji ve viroloji;
- okyanusbilim (su kütlelerinin durumunu ve diğer görevleri değerlendirmek için fitoplankton çalışması);
- nanoteknoloji ve mikropartikül analizi.
İmmünoloji
İnsan bağışıklık sistemi çok çeşitli hücrelerden oluşur. İmmünolojide akış sitometrisi, yapılarını ve işlevlerini değerlendirmeyi, yani morfofonksiyonel yürütmeyi mümkün kılar.analiz.
Bu tür araştırmalar bağışıklığın karmaşık doğasını anlamaya yardımcı olur. Hücre fenotipleri, antijenler tarafından aktivasyon, patolojilerin gelişimi ve diğer faktörlerin bir sonucu olarak değişir. Sitoflorometri, karmaşık bir karışımdaki bağışıklık hücrelerinin alt popülasyonlarını ayırabilir ve bunların zaman içindeki tüm değişikliklerini değerlendirebilir.
Onkoloji
Onkolojideki en önemli görevlerden biri hücrelerin türlerine göre farklılaşmasıdır. Onkohematolojide akış sitometrisi ile analiz ilkesi aşağıdaki fenomene dayanmaktadır: bir numune özel bir floresan boya ile muamele edildiğinde sitoplazmik proteinlere bağlanır. Aktif olarak çoğalan hücrelerde bölünmeden sonra içeriği yarı yarıya azalır. Buna göre, hücre lüminesansının yoğunluğu iki kat azalır.
Çoğalan hücreleri tespit etmenin başka yolları da var:
- DNA bağlayıcı boyaların kullanımı (propidium iyodür);
- etiketli urasil kullanımı;
- hücre döngüsünün düzenlenmesinde yer alan siklin proteinlerinin artan ekspresyon seviyesinin kaydı.
