Kromatografi, maddeleri ayırma yöntemlerinden biridir. Mikropartiküllerin fiziksel ve kimyasal özelliklerinin sonraki kalitatif ve kantitatif analizi için kullanılır. Bu teknolojinin bir varyasyonu afinite kromatografisidir. Moleküler afinite özelliğini kullanarak protein bileşiklerini farklılaştırma fikri, bilimde birkaç on yıldır bilinmektedir. Bununla birlikte, gelişimini ancak son yıllarda, matris olarak kullanılan oldukça gözenekli hidrofilik malzemelerin tanıtılmasından sonra almıştır. Bu yöntem hem analitik problemlerin (maddelerin ayrılması ve tanımlanması) hem de hazırlık problemlerinin (saflaştırma, konsantrasyon) çözülmesine izin verir.
Öz
Afinite kromatografisi (Latince affinis - “bitişik”, “ilgili” kelimesinden gelir), bir ara molekül (ligand veya afinant) ile bir hedef molekül arasında oldukça spesifik bağların oluşumu olan afinite etkileşimlerine dayanır. Bu mekanizmalar doğada yaygındır (arabulucuların veya hormonların ve reseptörlerin bağlantısı, antikorlar veantijenler, polinükleo titlerin hibridizasyonu ve diğer işlem türleri). Tıpta afinite kromatografisi 1951'den beri pratik amaçlar için kullanılmaktadır
Bileşenler şu şekilde ayrılır:
- İzole edilecek maddeyi içeren çalışma solüsyonu sorbentten geçirilir;
- sorbent matrisi üzerinde biriken ligand bu maddeyi tutar;
- konsantre (birikim);
- bir çözücü ile yıkanarak sorbentten izole edilen maddenin ekstraksiyonu.
Bu yöntem tüm hücreleri izole etmenizi sağlar. Geleneksel sorpsiyon kromatografisinden farkı, izole edilmiş bileşenin yüksek seçicilik ile karakterize edilen, sorbentte güçlü bir biyospesifik bağlanmasının olmasıdır.
Adsorbanlar
Adsorban olarak aşağıdaki maddeler kullanılır:
- Agardan elde edilen bir polisakarit olan agaroz bazlı jel bileşikleri. En yaygın olarak kullanılan 3 çeşittir: sefaroz 4B, CL (çapraz bağlı agaroz) ve affi-jel. İkinci bileşim, agaroz ve poliakrilamidin modifiye edilmiş bir jelidir. Daha yüksek biyolojik eylemsizliğe, yüksek kimyasal ve termal dirence sahiptir.
- Silika (silika jel).
- Cam.
- Organik polimerler.
Ligand teması sırasında mekanik engelleri ortadan kaldırmak için, onu taşıyıcıdan ayırmak için ek maddeler kullanılır (peptidler, diaminler, poliaminler, oligosakkaritler).
Ekipman
Afinite kromatografi ekipmanı aşağıdaki ana birimleri içerir:
- mobil faz için depolama tankları (eluent);
- orta besleme için yüksek basınç pompaları (çoğunlukla pistonlu);
- eluentleri tozdan temizlemek için filtre;
- dozlama cihazı;
- karışım ayrımı için kromatografik kolon;
- Sütundan ayrılan ayrı bileşenleri algılamak için dedektör;
- kromatogram kaydediciler ve mikroişlemci birimi (bilgisayar).
Çözünmüş hava miktarını az altmak için öncelikle mobil fazdan helyum geçirilir. Eluentin konsantrasyonunu değiştirmek için programlayıcı tarafından kontrol edilen birkaç pompa kurulur. Kromatografik kolonlar paslanmaz çelikten (korozyon direnci için artan gereksinimler için), camdan (evrensel seçenek) veya akrilikten yapılmıştır. Hazırlık amacıyla çapları 2 ila 70 cm arasında değişebilir Analitik kromatografide Ø10-150 µm mikrokolonlar kullanılır.
Detektörlerin hassasiyetini artırmak için, karışıma, spektrumun ultraviyole veya görünür bölgesinde daha fazla ışını emen maddelerin oluşumuna katkıda bulunan reaktifler eklenir.
Metodoloji
Sıvı afinite kromatografisinin 2 ana türü vardır:
- Sütunun sabit bir faz ile doldurulduğu ve içinden bir karışım ile bir karışımın geçirildiği koloneluent. Ayırma basınç altında veya yerçekimi altında gerçekleşebilir.
- İnce katman. Eluent, kılcal kuvvetlerin etkisi altında düz adsorban tabaka boyunca hareket eder. Adsorban bir cam levhaya, seramik veya kuvars çubuğa, metal folyoya uygulanır.
İşin ana aşamaları şunları içerir:
- adsorbanın hazırlanması, ligandın taşıyıcı üzerine sabitlenmesi;
- Ayırma karışımının kromatografik kolona beslenmesi;
- mobil faz yükleme, ligand ile bileşen bağlama;
- bağlı maddeyi izole etmek için faz değişimi.
Hedef
Afinite kromatografisi aşağıdaki madde türlerini izole etmek için kullanılır (kullanılan ligand türü parantez içinde belirtilmiştir):
- enzimatik inhibitörlerin, substratların ve kofaktörlerin (enzimler) analogları;
- Genetik yabancılık, virüsler ve hücreler (antikorlar) belirtileri olan biyoorganik maddeler;
- yüksek moleküler ağırlıklı karbonhidratlar, monosakkarit polimerler, glikoproteinler (lektinler);
- nükleer proteinler, nükleotidiltransferazlar (nükleik asitler);
- reseptörler, taşıyıcı proteinler (vitaminler, hormonlar);
- hücre zarları (hücreler) ile etkileşime giren proteinler.
Bu teknoloji aynı zamanda immobilize enzimler elde etmek için kullanılır ve bunların selüloza bağlanması, immünosorbentlerin üretilmesini sağlar.
DNA bağlayıcı proteinlerin kromatografisi
DNA bağlayıcı proteinlerin izolasyonu,heparin. Bu glikozaminoglikan, çok çeşitli molekülleri bağlama yeteneğine sahiptir. Bu grubun proteinlerinin afinite kromatografisi, aşağıdaki gibi maddeleri izole etmek için kullanılır:
- Translasyonun başlama ve uzama faktörleri (nükleik asit moleküllerinin ve proteinlerin sentezi);
- restrictases (çift sarmallı DNA'daki belirli dizileri tanıyan enzimler);
- DNA ligazları ve polimerazları (yeni bir kimyasal bağ oluşturmak için iki molekülün birleşmesini katalize eden ve DNA replikasyonunda yer alan enzimler);
- bağışıklık ve inflamatuar süreçlerde önemli rol oynayan serin proteaz inhibitörleri;
- büyüme faktörleri: fibroblast, Schwann, endotelyal;
- hücre dışı matrisin proteinleri;
- hormon reseptörleri;
- lipoproteinler.
Onur
Bu yöntem, reaktif bileşiklerin (enzimler ve daha büyük kümeler - virüsler) izolasyonu için en spesifik yöntemlerden biridir. Ancak sadece biyolojik olarak aktif maddeleri izole etmek için kullanılmaz.
Küçük miktarlarda antikorların tespiti, poliadenilik asidin kantitatif değerlendirmesi, dehidrojenazların moleküler kütlelerinin hızlı belirlenmesi, belirli kirleticilerin uzaklaştırılması, aktif olmayan tripsin formunun aktivasyon kinetiğinin incelenmesi, insanın moleküler yapısı interferonlar - bu, afinitenin kullanıldığı çalışmaların tam listesi değildir. Klinikte kullanımı şu avantajlardan kaynaklanmaktadır:
- Etkili temizleme özelliğiproteinler, polisakkaritler, nükleik asitler. Fiziksel ve kimyasal özelliklerinde biraz farklılık gösterirler ve hidroliz, denatürasyon ve diğer yöntemlerde kullanılan diğer tedavi türleri sırasında aktivitelerini kaybederler.
- Maddelerin ayrılma hızı, sürecin dinamik doğası.
- Ayrışma sabitlerini belirlemek için özel enzim saflaştırmasına ve izoenzim homojenizasyonuna gerek yoktur.
- Çok çeşitli maddeleri ayırabilir.
- Ligandların düşük tüketimi.
- Büyük hacimlerdeki maddeleri ayırma imkanı.
- Biyolojik makromoleküllerin bağlanmasının tersinir süreci.
Bu teknik, ek bir alan (yerçekimi, elektromanyetik) uygulamak için başkalarıyla birleştirilebilir. Bu, kromatografinin teknik özelliklerini genişletmenize olanak tanır.
Enzimatik mühendisliği
Bu yöntem sayesinde, yeni bir biyoteknoloji dalı olan enzim mühendisliğinin aktif gelişimi başladı.
Enzim izolasyonu için afinite kromatografisi aşağıdaki avantajlara sahiptir:
- enzimlerin daha kısa sürede büyük miktarlarda elde edilmesi, sonuç olarak - fiyatlarındaki düşüş;
- enzimlerin hareketsizleştirilmesi, tıp ve endüstrideki uygulama kapsamını önemli ölçüde genişletebilir;
- Enzimlerin çözünmeyen katı bir destekle birleşmesi, doğal ve fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynayan mikroçevrenin etkisini ve reaksiyonların yönünü incelemeyi mümkün kılar.
